一(yī)次性(xìng)使用(yòng)的(dí)組件(jiàn)為生物(wù)製(zhì)品(pǐn)的(dí)生產帶(dài)來了很多(duō)優(yōu)勢。它們幹淨(jìng)，買(mǎi)來即用，不需(xū)要滅菌，因此也(yě)就(jiù)減(jiǎn)少了如(rú)衝洗(xǐ)用(yòng)水(shuǐ)係統（WFI）和蒸(zhēng)汽(qì)發生器檢修的需(xū)求。一次性的組件不能(néng)用於後(hòu)續(xù)的(dí)操(cāo)作，消除(chú)了工(gōng)藝流(liú)程運(yùn)行之(zhī)間交叉(chā)汙染的可(kě)能(néng)性。因(yīn)為(wéi)減少(shǎo)或(huò)摈(bìn)棄了對不(bù)鏽鋼設(shè)備的(dí)需求，也可(kě)以避免了設備組裝的長(cháng)周期(qī)。係統(tǒng)的(dí)復雜度降(jiàng)低(dī)，因(yīn)而所(suǒ)涉(shè)及(jí)的(dí)工程需求(qiú)也同(tóng)樣減(jiǎn)少。再(zài)也無(wú)需(xū)在位清洗(xǐ)（CIP）或(huò)在(zài)位滅(miè)菌（SIP）操(cāo)作(zuò)，以(yǐ)及相關的(dí)管(guǎn)道，閥門，控製(zhì)器或容(róng)器的(dí)壓(yā)力(lì)等級(jí)。此(cǐ)外，一次性(xìng)組件的使(shǐ)用還降低了(liǎo)驗證(zhèng)的復雜(zá)度(dù)。因為(wéi)幾(jī)乎(hū)沒(méi)有可反(fǎn)復使(shǐ)用的(dí)組(zǔ)件，也(yě)就沒(méi)有什(shí)麼(mó)項目(mù)需(xū)要(yào)跟(gēn)蹤，也就(jiù)節省了(liǎo)大量(liáng)的滅菌，清潔驗(yàn)證(zhèng)研(yán)究。zui後，通(tōng)過消(xiāo)除了堅固的管道係統和固定發(fā)酵罐(guàn)的(dí)限(xiàn)製(zhì)，一次性組件(jiàn)還(huán)有利(lì)於(yú)實(shí)現更(gēng)快速的改裝以(yǐ)便用於新(xīn)流(liú)程(chéng)的運行。一次性組件(jiàn)的使用(yòng)可在(zài)勞(láo)力(lì)，設備(bèi)，廠(chǎng)房(fáng)設計(jì)以及驗(yàn)證方(fāng)麵實(shí)實在在地節(jié)省(shěng)可觀的費用。一(yī)次(cì)性的(dí)組件(jiàn)包括(kuò)：生物(wù)處理(lǐ)袋(dài)，管(guǎn)，囊式過濾(lǜ)器，切向流艙(cāng)，生(shēng)物反應(yīng)器(qì)，層析(xī)艙及(jí)混合(hé)係統。
圖(tú)1. 波浪(làng)生物反(fǎn)應(yīng)器(qì)。20/50EH 係(xì)統。
一(yī)次性生物反(fǎn)應器(qì)的(dí)使(shǐ)用(yòng)及放大(dà)
在某些應用(yòng)中，灌流(liú)式細胞(bāo)培(péi)養比(bǐ)分(fēn)批和補(bǔ)料(liào)分批(pī)工藝更(gēng)具優(yōu)勢。操(cāo)作方式的選擇是(shì)根據工藝規程(chéng)所(suǒ)的綜合需求(qiú)。工藝的(dí)優化(huà)常常是(shì)評估(gū)哪種類型生(shēng)產zui有(yǒu)效的(dí)*途徑(jìng)。分批是(shì)zui常用的(dí)以終(zhōng)點為依(yī)據的生(shēng)產(chǎn)方(fāng)式。在(zài)分批生(shēng)產(chǎn)方(fāng)式(shì)中(zhōng)，生物反(fǎn)應器在接種，培養並達到(dào)的細(xì)胞密度(dù)和(hé)產品濃(nóng)度(dù)的時即收集(jí)細(xì)胞上清。在補料(liào)分批工藝(yì)中，在(zài)生(shēng)產流(liú)程(chéng)的晚期進行補加(jiā)原料以(yǐ)改進細胞活力(lì)，增加(jiā)總(zǒng)的產率(shuài)。在灌(guàn)流方式中(zhōng)，原料溶液持(chí)續(xù)加入(rù)生物反應器中(zhōng)，用過的培養(yǎng)基也(yě)不(bù)斷排(pái)出。以(yǐ)灌流(liú)方式來(lái)運行(háng)工(gōng)藝(yì)能增加培養的持久性(xìng)和(hé)細胞(bāo)密度(dù)，反過(guò)來又(yòu)增(zēng)加了整體(tǐ)的生產率(shuài)3,4,9。我們的目的(dí)蛋白(bái)，AZ-IL2B，是一個二聚(jù)體(tǐ)融合蛋(dàn)白(bái)，由人IL-2 連接(jiē)人免疫(yì)球蛋(dàn)白特異針對pIgR 的(dí)scFv 區(qū)域而組成6。這個融合蛋白(bái)灌(guàn)流方式的(dí)生產(chǎn)。細胞(bāo)產生的蛋白水平(píng)較低，而(ér)且(qiě)AZ-IL2B 很(hěn)脆(cuì)弱，特(tè)別是(shì)在(zài)37º C。灌流生產(chǎn)所(suǒ)帶(dài)來(lái)的生產容量增加，以及縮短了不穩定蛋白在(zài)反(fǎn)應器中(zhōng)停留的時(shí)間，都有助於(yú)實現(xiàn)更高(gāo)的產(chǎn)量。本(běn)文總結了Wave Biotech, LLC所(suǒ)生(shēng)產(chǎn)的一次性(xìng)生物(wù)反(fǎn)應器(qì)以灌(guàn)流(liú)方式(shì)從25 升 工作(zuò)體積放(fàng)大(dà)至500升(shēng) 工(gōng)作體積的生產放大(dà)結果(guǒ)。我們將比(bǐ)較25 升(shēng)，100 升(shēng)和500 升 工(gōng)作(zuò)體(tǐ)積(jī)的三(sān)個不同係(xì)統(tǒng)。對(duì)於每(měi)個生(shēng)物(wù)反應器的運行(háng)都測定了以(yǐ)
下參數，包(bāo)括：細胞數量(liáng)和活力，產生的(dí)蛋白數量，葡萄(táo)糖(táng)和(hé)乳酸(suān)水平。對(duì)每(měi)個係(xì)統間的(dí)這些(xiē)參(cān)數(shù)進(jìn)行(háng)了(liǎo)比(bǐ)較(jiào)，結(jié)果顯示三個不同體積的(dí)生(shēng)物反(fǎn)應(yīng)器是相(xiāng)當的。
材(cái)料(liào)與(yǔ)方法(fǎ)生物(wù)反應器(qì)描(miáo)述
每(měi)個生(shēng)物反應器(qì)由一個(gè)靈活(huó)的，一次(cì)性的，預先滅菌的塑料袋組成(chéng)， 這(zhè)個塑料袋稱為細(xì)胞(bāo)袋(Cellbag®)。在操作中，細(xì)胞(bāo)袋(dài)放置(zhì)在搖擺平(píng)台上,充入(rù)部(bù)分培(péi)養基(jī)（圖1）。細(xì)胞袋的剩餘體積則充(chōng)入了(liǎo)由(yóu)二(èr)氧(yǎng)化(huà)碳(tàn)（CO2）和(hé)氧氣(qì)（O2）組(zǔ)成(chéng)的(dí)氣(qì)體(tǐ)混合物(wù)。這(zhè)些氣(qì)體是(shì)通過預留(liú)在細胞袋(dài)上(shàng)的(dí)無(wú)菌過濾(lǜ)入口(kǒu)來添(tiān)加(jiā)的(dí)。空氣流提供了氧氣，以(yǐ)及控製pH和(hé)去(qù)除(chú)二氧化碳所(suǒ)需的氣體(tǐ)交(jiāo)換。廢(fèi)氣則通過另一(yī)個無菌過(guò)濾(lǜ)器和背壓控製(zhì)閥(fá)排(pái)出。背壓控(kòng)製閥(fá)確保了細胞(bāo)袋(dài)在(zài)任(rèn)何(hé)空(kōng)氣流(liú)下(xià)總是充滿的。閥門也防止了細胞(bāo)袋(dài)的過度膨脹(zhàng)以及(jí)爆炸(zhà)的可能(néng)。填充(chōng)空氣的(dí)頂部空(kōng)間占(zhān)據了(liǎo)細(xì)胞(bāo)袋被填(tián)滿時的一半體(tǐ)積(jī).例如，一個充滿時是50 升總(zǒng)體積的細(xì)胞(bāo)袋(dài)將包含25升 細胞懸(xuán)液和(hé)25 升 空(kōng)氣。空氣(qì)在(zài)培(péi)養時持續(xù)地(dì)穿(chuān)過頂(dǐng)部空間(jiān)。流程中的氣(qì)體，如CO2和(hé)O2，以可控(kòng)的(dí)方式與空(kōng)氣混(hùn)合。液(yè)體混匀以及(jí)氣體的物(wù)質傳遞(dì)是通(tōng)過來回(huí)搖動細(xì)胞袋(dài)而實(shí)現的。這(zhè)種(zhǒng)搖(yáo)動在(zài)氣(qì)相和液相(xiāng)對(duì)分(fēn)界(jiè)麵(miàn)產生了(liǎo)波(bō)動。這(zhè)些波動大(dà)大(dà)增加(jiā)表(biǎo)麵積(jī)，能提(tí)高氣(qì)體轉(zhuǎn)移。波浪(làng)運動還促進細(xì)胞(bāo)和顆(kē)粒離開底部懸(xuán)浮(fú)（防止沉(chén)降(jiàng)）以及(jí)大麵(miàn)積(jī)混(hùn)匀(yún)，同時不會給細胞(bāo)帶來(lái)任何傷害(hài)。搖動可(kě)以通過設(shè)定搖(yáo)擺角度(dù)和每(měi)分鐘(zhōng)的搖(yáo)動次數來控製。這些(xiē)參數(shù)必(bì)須根據細(xì)胞袋(dài)中(zhōng)的使用(yòng)體積(jī)來確定。細胞(bāo)袋的溫(wēn)度(dù)可(kě)通(tōng)過(guò)加熱(rè)器來控(kòng)製，此加熱(rè)器位(wèi)於設備(bèi)的底盤，對(duì)細胞袋的(dí)底部進行(háng)加熱(rè)。加熱器是(shì)由同(tóng)樣位(wèi)於(yú)單(dān)元(yuán)的底(dǐ)盤的(dí)非(fēi)插入式的溫度傳感器(qì)來(lái)調節8。另外(wài)還(huán)設計了(liǎo)特(tè)別(bié)的接(jiē)口(kǒu)，以供(gōng)無菌加料及樣品的取(qǔ)出(chū)，而(ér)無(wú)需(xū)將(jiāng)生物反應器(qì)置於(yú)層(céng)流櫃中。可用無菌的管道連接(jiē)器(qì)將(jiāng)培(péi)養(yǎng)基，緩衝液和葡(pú)萄糖(táng)儲存液(yè)加(jiā)入係統中。使(shǐ)用的生物反應器分別為20/50EH 係(xì)統，200 係統(tǒng)和1000 係統（WaveBiotech, LLC）。
細胞解凍(dòng)與(yǔ)增殖
我(wǒ)們(mén)使用(yòng)了(liǎo)P6A2細胞係(xì)，它是(shì)一(yī)種(zhǒng)基於CHO的懸浮克隆，選擇這個細胞株的(dí)原因(yīn)在(zài)於其(qí)蛋白生(shēng)產及生長(cháng)特(tè)性(xìng)俱(jù)佳。細胞(bāo)在(zài)120毫升過濾的培養基中解(jiě)凍，並放置在150毫(háo)升(shēng)的(dí)轉(zhuǎn)瓶內(nèi)。細胞在轉瓶(píng)內(nèi)擴(kuò)增，直到有(yǒu)足(zú)夠(gòu)的細(xì)胞(bāo)來(lái)接種(zhǒng)更(gēng)大的轉瓶，一(yī)直至6升(shēng)。一旦培養(yǎng)物充(chōng)分擴增，即(jí)被轉(zhuǎn)移到(dào)細胞(bāo)袋中接種(zhǒng)。轉瓶內的(dí)細胞密(mì)度維持在約2×105 細胞/毫升。用於擴增(zēng)的培養基是(shì)帶(dài)有添加(jiā)劑(jì)的(dí)無血清的IS CHO-V (IrvineScientific)。我(wǒ)們使用了血(xiě)球計數器(qì)來計(jì)算(suàn)細胞數量，並利(lì)用(yòng)台(tái)盼藍染(rǎn)料排(pái)除分(fēn)析(xī)來確定細(xì)胞(bāo)活力(lì)。利用Bioprofile® 300A (Nova Biomedical)來分析(xī)細(xì)胞培(péi)養(yǎng)試(shì)劑。pH值是通(tōng)過細(xì)胞(bāo)袋(dài)探頭進(jìn)行(háng)在(zài)綫測定，或(huò)用PHM220 pH計 (Meter Lab)來(lái)離綫(xiàn)測定(dìng)。氧氣，二(èr)氧化(huà)碳，溫(wēn)度，搖速(sù)及搖擺角度是由Wave Bioreactor的(dí)控製器來(lái)測(cè)定並(bìng)控(kòng)製的。
細胞袋(dài)接種
細胞一(yī)般以(yǐ)1×105-4×105 細胞/毫(háo)升的(dí)密度接種在細胞袋(dài)生物(wù)反應器中。我(wǒ)們(mén)曾(zēng)以(yǐ)更低(dī)的(dí)密(mì)度(dù)（如(rú)6×104 細胞(bāo)/毫(háo)升）接種(zhǒng)細(xì)胞，對細(xì)胞(bāo)生(shēng)長(cháng)或(huò)生(shēng)產(chǎn)也沒(méi)有(yǒu)不良影(yǐng)響(xiǎng)。一(yī)旦細胞(bāo)在轉(zhuǎn)瓶(píng)中(zhōng)充(chōng)分擴增，就(jiù)進行細胞(bāo)袋(dài)生物(wù)反(fǎn)應器的接種(zhǒng)。這(zhè)可將轉瓶的(dí)內容(róng)物(wù)直(zhí)接(jiē)轉移到(dào)生(shēng)物(wù)反應器(qì)內。在(zài)此(cǐ)時，生物(wù)反應器已經充滿了(liǎo)二氧化碳(tàn)和氧氣，並包(bāo)含溫(wēn)暖的(dí)培(péi)養基 (37° C)。細胞懸浮(fú)液(yè)由無菌接(jiē)管連接到(dào)細胞袋，然後(hòu)通過無
菌的端(duān)口(kǒu)泵入生物反(fǎn)應器(qì)中(zhōng)。
生物反(fǎn)應(yīng)器裏的增殖(zhí)
細胞袋(dài)中(zhōng)的(dí)細胞能(néng)達(dá)到比(bǐ)轉瓶更高(gāo)的密度。這zui有可能是由於細(xì)胞(bāo)袋(dài)內(nèi)溶(róng)氧(yǎng)的增加，以及(jí)控(kòng)製pH的(dí)能(néng)力。在(zài)轉瓶中， 密度維(wéi)持在(zài)2×105-6×105 細(xì)胞/毫(háo)升，加入(rù)細(xì)胞袋後， 細胞的(dí)密(mì)度(dù)增加至8×105-1×106 細胞/毫升，直到(dào)在(zài)灌流開始(shǐ)後，P6A2細胞(bāo)克(kè)隆的密度可(kě)高(gāo)達(dá)3×107 細(xì)胞/毫升(shēng)。
灌(guàn)流
一(yī)旦(dàn)細胞(bāo)達到1×106-2×106 細(xì)胞(bāo)/毫升，即可開(kāi)始灌流。收集(jí)用過的培養基(jī)，同(tóng)時以相同速率向生物(wù)反應器(qì)中(zhōng)加入新(xīn)鮮(xiān)的培養(yǎng)基，養分(fēn)，調(tiáo)控(kòng)pH的緩衝(chōng)液。這(zhè)是由生物(wù)反應器的以重量為基礎的灌流控製器(qì)來直(zhí)接(jiē)控製(zhì)的(dí)。在這(zhè)個細胞密(mì)度(dù)下每天(tiān)的(dí)體(tǐ)積交(jiāo)換(huàn)約(yuē)為(wéi)總(zǒng)體積(jī)的70-75%。隻要(yào)細胞活力高(gāo)於(yú)50%，反應(yīng)器就(jiù)持(chí)續(xù)灌流。一(yī)旦細胞密度達(dá)到約2×107 細胞/毫(háo)升，控(kòng)製乳酸及(jí)其他毒副產物(wù)的累積就變(biàn)得(dé)更(gēng)加困難，反過來導致(zhì)pH的(dí)控製也非(fēi)常困難。到(dào)此(cǐ)階段(duàn)，要(yào)移除部分(fēn)細胞(bāo)從(cóng)而維持(chí)密(mì)度(dù)在1×107-2×107 細胞/毫(háo)升(shēng)。每(měi)天(tiān)的(dí)體積(jī)交換(huàn)提(tí)高至約(yuē)100%，包括培(péi)養基，緩(huǎn)衝(chōng)液及其他添加劑。利用孔徑為0.2μm的中(zhōng)空(kōng)纖維微(wēi)孔過濾柱來灌流細胞培養上(shàng)清。
通(tōng)過ELISA和(hé)Western Blot進(jìn)行蛋(dàn)白分析(xī)
AZ-IL2B目(mù)標蛋白(bái)的定(dìng)量是通過ELISA進(jìn)行(háng)的。細胞培(péi)養上清(qīng)是以一(yī)種於檢(jiǎn)測(cè)和(hé)定量AZ-IL2B嵌合(hé)體的方法(fǎ)來(lái)分析的。細(xì)胞培(péi)養上清中(zhōng)的AZ-IL2B通(tōng)過與(yǔ)包被pIgR區域(yù)特異(yì)性(xìng)抗(kàng)體(tǐ)的微滴定板的(dí)結合而(ér)被捕(bǔ)獲，捕獲的AZ-IL2B通過生物素標記(jì)的(dí)山羊抗人IL-2多(duō)克隆抗體（R&DSystems, Inc.）來(lái)檢(jiǎn)測。鏈(liàn)親(qīn)和素(sù)-HRP 結(jié)合物（ BD Biosciences,Pharmingen）加入(rù)zui後(hòu)的(dí)檢測步驟中(zhōng)。TMB底物溶液加入反應中，與(yǔ)
反(fǎn)應(yīng)中(zhōng)存在的酶直(zhí)接(jiē)反映(yìng)並產生(shēng)顏(yán)色(sè)變化，這(zhè)種顏色變(biàn)化(huà)與樣品中AZ-IL2B的量成正(zhèng)比(bǐ)。利用(yòng)AZ-IL2B標準曲綫和質(zhì)量對(duì)照來(lái)測(cè)定(dìng)細(xì)胞培養上(shàng)清樣(yàng)品(pǐn)中(zhōng)AZ-IL2B的量(liáng)。根據標準的步驟(zhòu)來(lái)進行(háng)western blot分析7。蛋(dàn)白(bái)通(tōng)過8-16%的Tris-甘(gān)氨酸聚(jù)丙(bǐng)烯(xī)酰(xiān)胺(àn)凝(níng)膠電泳(yǒng)進(jìn)行大小分離，並轉移到硝(xiāo)酸(suān)纖(xiān)維(wéi)素膜(mó)上。膜與一抗(kàng)——兔抗人白介素-2 的多克隆(lóng)抗體(tǐ)（ ChemiconInternational, Inc.）及二(èr)抗——鹼性磷(lín)酸(suān)酶(méi)結合(hé)的驢抗(kàng)兔(tù)IgG 抗體
（Pierce Biotechnology, Inc.）一起孵育。
圖(tú)3. 每(měi)天(tiān)葡萄(táo)糖和乳(rǔ)酸水平的(dí)化學分析。WVA，WVB 和(hé)WVC 生物(wù)反應(yīng)器運(yùn)行(háng)的葡(pú)萄糖(táng)和乳酸(suān)水(shuǐ)平。
圖4. 每天(tiān)的蛋白(bái)濃(nóng)度(dù)。三(sān)個(gè)生物(wù)反應器運行的蛋(dàn)白水平(píng)的(dí)比(bǐ)較，以(yǐ)毫(háo)克/升表示(shì)。蛋(dàn)白水平通過(guò)ELISA 測(cè)定。
結果(guǒ)
生物(wù)反(fǎn)應器(qì)運行WVA，WVB和WVC分(fēn)別(bié)指的(dí)是Wave Biotech®的
生物反應(yīng)器(qì)20/50EH係(xì)統(tǒng)，200係(xì)統和(hé)1000係統。
細(xì)胞(bāo)計(jì)數與活力
圖2顯(xiǎn)示了每(měi)種生(shēng)物(wù)反應器的(dí)細(xì)胞(bāo)生長和密度(dù)相(xiāng)當。生物反應(yīng)器運(yùn)行WVB沒有達(dá)到WVA和WVC那(nà)麼(mó)高的(dí)細(xì)胞密度(dù)，但是確實達到(dào)了1.2×107 細胞/毫升(shēng)。這(zhè)是由(yóu)於在第8天加(jiā)入了(liǎo)高濃度的葡萄糖後導致(zhì)的葡萄(táo)糖峰（圖3）。1.2×10在運行生物(wù)反應器WVA後，我們發現現有的(dí)培養(yǎng)基配方和(hé)投料(liào)策(cè)略無法(fǎ)支持超(chāo)過2×107 細胞/毫升以上(shàng)的(dí)細胞密度(dù)。在細(xì)胞密(mì)度達(dá)到(dào)3×107 細(xì)胞(bāo)/毫(háo)升後，WVA的(dí)培(péi)養(yǎng)物的(dí)細(xì)胞(bāo)活力(lì)和(hé)細(xì)胞(bāo)生長(cháng)顯(xiǎn)著(zhù)下(xià)降，並(bìng)無(wú)法恢復，這可能(néng)是由於缺乏營養物(wù)，以(yǐ)及毒(dú)性物質的(dí)積累(léi)，包(bāo)括培(péi)養(yǎng)物中的(dí)高水平乳(rǔ)酸（圖3）5。氧合(hé)不(bù)是一(yī)個問(wèn)題，因為我(wǒ)們(mén)能調節向培養物中(zhōng)添加的(dí)氧氣(qì)量(liáng)。每(měi)個(gè)反(fǎn)應器(qì)運行中(zhōng)的溶(róng)氧維持在(zài)73-100%。2×10
對於隨後的(dí)反應器，在細胞(bāo)密度(dù)達到1.5×107 細胞/毫升或更(gēng)高(gāo)，乳酸水平達2.2 克(kè)/升或(huò)更高(gāo)時(shí)就(jiù)將(jiāng)部(bù)分細(xì)胞除去(qù)。通過去(qù)除(chú)細胞(bāo)和調整每(měi)天(tiān)的灌(guàn)流量，生物反應器(qì)運行被(bèi)延(yán)長(cháng)，收(shōu)獲了更多的蛋白。WVA需(xū)要更長時間才到(dào)達灌流密度(dù)（1.2×106 細胞/毫升），這可(kě)能是由於(yú)第6天溫度意外降至25° C。WVA灌流持續(xù)了13天，平(píng)均(jūn)產(chǎn)量(liáng)為(wéi)12.5 毫克(kè)/升，而WVB灌(guàn)流持續了(liǎo)18天，平均為(wéi)8.3 毫(háo)克(kè)/升(shēng)，比WVA多(duō)了(liǎo)5天，收獲(huò)蛋(dàn)白也多了6.7克(kè)。WVC灌流(liú)了(liǎo)16天，平(píng)均(jūn)產量為12.2 毫克/升(shēng)，比WVA多了(liǎo)3天，收(shōu)獲蛋(dàn)白(bái)也增加(jiā)了
16.4克。活力的(dí)增加及(jí)生物反應(yīng)器(qì)運行的延(yán)長都能(néng)使(shǐ)產(chǎn)量更高。
蛋白產量(liáng)
圖4比較(jiào)了每(měi)個(gè)運行的蛋(dàn)白濃度(dù)。WVA的(dí)蛋白(bái)濃度（37.5 毫(háo)克(kè)/升）比WVB（15.46 毫克/升）或(huò)WVC（27.91 毫克(kè)/升(shēng)）更(gēng)高(gāo)，這(zhè)是由於(yú)更高的(dí)細胞(bāo)密(mì)度。每個反應(yīng)器的(dí)整體(tǐ)蛋(dàn)白產(chǎn)量(liáng)如下：WVA 7.8克，WVB21.4克，WVC 149.2克。蛋(dàn)白(bái)產量與細胞(bāo)密(mì)度緊(jǐn)密關(guān)聯。這個(gè)解(jiě)釋是(shì)合理(lǐ)的，因為存(cún)在(zài)更多(duō)的(dí)細胞，自然(rán)也有(yǒu)更多(duō)的(dí)細(xì)胞(bāo)生產蛋白。WVB並(bìng)沒有達(dá)到(dào)WVA或WVC那(nà)麼高(gāo)的蛋(dàn)白濃度(dù)。這與(yǔ)觀察到的細胞密度更低是一(yī)致的。在圖(tú)，5b和5c中，每個反(fǎn)應器(qì)運行的細(xì)胞密度(dù)與(yǔ)蛋(dàn)白濃度重(zhòng)疊(dié)。蛋白濃度的增加(jiā)與細胞密(mì)度(dù)直接相(xiāng)關(guān)。在(zài)每個(gè)反(fǎn)應(yīng)器(qì)運行(háng)終(zhōng)止(zhǐ)時(shí)確定(dìng)細(xì)胞(bāo)活力的減(jiǎn)少，以及蛋白產(chǎn)量的(dí)減(jiǎn)少(shǎo)。
圖5. 蛋(dàn)白水平(píng)與活細(xì)胞密度。細胞密度(dù)與蛋白水平(píng)的關(guān)聯。A. 生物(wù)反(fǎn)應器(qì)運行WVA。B. 生(shēng)物反應(yīng)器(qì)運(yùn)行WVB。C. 生物反應(yīng)器運行WVC。
葡萄糖和乳酸濃度(dù)
每個運(yùn)行中的(dí)葡(pú)萄糖和(hé)乳(rǔ)酸(suān)濃(nóng)度在(zài)圖3中顯示。每個運行(háng)的水平(píng)基本相(xiāng)似(sì)，除了(liǎo)第(dì)9天WVB的(dí)葡萄糖(táng)峰。由(yóu)於(yú)每(měi)個反應器運行(háng)持(chí)續，細胞(bāo)密(mì)度不(bù)斷增加(jiā)，葡(pú)萄(táo)糖(táng)被消(xiāo)耗(hào)，而(ér)乳酸增(zēng)加。每(měi)個(gè)運行(háng)後期葡(pú)萄糖(táng)濃度的尖峰是(shì)由於當生物反應器葡萄糖水(shuǐ)平降低(dī)至2.0 克(kè)/升時(shí)，添(tiān)加了50%的葡(pú)萄(táo)糖儲(chǔ)存液(yè)而引起的(dí)。
蛋(dàn)白(bái)分(fēn)析
AZ-IL2B 作為(wéi)一個(gè)二聚體蛋白，跑(pǎo)膠時分子(zǐ)量在(zài)36-50 kDa。圖6(a)是WVD的(dí)Western blot，WVD反應(yīng)器(qì)的工(gōng)作體(tǐ)積(jī)為10 升（WaveBiotech 20/50EH係(xì)統(tǒng)）。圖6(b)是WVC的Western blot，它的工作體(tǐ)積為500升。圖中通(tōng)過Western blot對(duì)第3天(tiān)到第(dì)9天進行了比(bǐ)較(jiào)，顯(xiǎn)示小(xiǎo)型反應器與大型反(fǎn)應器(qì)產生(shēng)的蛋白之(zhī)間(jiān)並(bìng)無區(qū)別。
討論
Wave Biotech的一次性生物(wù)反(fǎn)應(yīng)器從(cóng)25升放大到500升，對(duì)細胞(bāo)
生(shēng)長(cháng)或蛋白生(shēng)產沒(méi)有(yǒu)不良影響(xiǎng)。其他影響(xiǎng)活(huó)力和(hé)蛋白產(chǎn)量的因(yīn)素包括高細胞密(mì)度，不(bù)合適的添加(jiā)劑濃度(dù)，以(yǐ)及(jí)溫度波動。不僅每(měi)個(gè)係(xì)統規格所產(chǎn)生(shēng)的蛋(dàn)白水平相(xiāng)似，而(ér)且產(chǎn)生(shēng)的蛋白在Western blot分析和生(shēng)物(wù)活性測試（數據未顯示）時也一致。每(měi)個(gè)係統(tǒng)的(dí)細胞生長和倍增時間(jiān)也是(shì)相(xiāng)當的(dí)。平均(jūn)的蛋(dàn)白濃(nóng)度(dù)與(yǔ)細(xì)胞密度(dù)直接相(xiāng)關(guān)。每個(gè)生物(wù)反應器的(dí)葡萄糖(táng)消耗(hào)量與(yǔ)乳(rǔ)酸產(chǎn)量(liáng)是(shì)類(lèi)似的(dí)。隨(suí)著(zhuó)每個(gè)生(shēng)物(wù)反應(yīng)器(qì)的運行，葡(pú)萄糖水平下降，而乳酸水平上升選擇(zé)一次性的(dí)生(shēng)物反(fǎn)應器(qì)實(shí)現(xiàn)了生物反應器(qì)運行(háng)之間的(dí)快速轉換(huàn)。生(shēng)物反應(yīng)器(qì)的(dí)安裝，接種以及處(chǔ)理(lǐ)都很(hěn)輕鬆，因(yīn)此生物反(fǎn)應(yīng)器(qì)運行的終止(zhǐ)以(yǐ)及(jí)新反(fǎn)應(yīng)器的接種能(néng)在(zài)同一天內完成。10升，25升和100升生物反(fǎn)應器能(néng)在標(biāo)準的(dí)8小(xiǎo)時工作日(rì)內(nèi)取下(xià)並(bìng)重(zhòng)新接種(zhǒng)。500升細胞(bāo)袋(dài)的清空，填充以及培(péi)養基(jī)預熱(rè)需要更(gēng)長的時(shí)間，但(dàn)生(shēng)物反(fǎn)應(yīng)器(qì)也(yě)能在(zài)2個8小時工(gōng)作日內(nèi)取下(xià)並(bìng)重(zhòng)新接種。這個(gè)過程很簡單：細胞袋清(qīng)空，淨化(huà)並拋棄(qì)。新的(dí)預(yù)滅菌細胞(bāo)袋放(fàng)置在(zài)平(píng)台上(shàng)，並充入(rù)二(èr)氧化碳(tàn)和氧(yǎng)氣。添(tiān)加(jiā)培養(yǎng)基(jī)並加(jiā)熱，接(jiē)著進(jìn)行細胞接(jiē)種。10升和(hé)25升(shēng)工作體(tǐ)積(jī)的(dí)生物(wù)反(fǎn)應(yīng)器一般從轉(zhuǎn)瓶(píng)中(zhōng)接種(zhǒng)。100升(shēng)和500升(shēng)的(dí)生(shēng)物反(fǎn)應器則從(cóng)小(xiǎo)型(xíng)
的(dí)25升反(fǎn)應器(qì)中接種。係(xì)統從(cóng)25升到(dào)500升(shēng)的放大不(bù)僅簡(jiǎn)單而且成比例(lì)，隻需對(duì)體(tǐ)積變
化做(zuò)出調整。而培(péi)養(yǎng)基配方或添(tiān)加劑(jì)則(zé)無(wú)需改(gǎi)變。細胞(bāo)係在(zài)25升(shēng)，100升和500升反(fǎn)應體係中以相似的方式增(zēng)殖和生產。
圖(tú)6. 兩個(gè)生(shēng)物(wù)反應(yīng)器運(yùn)行(háng)的(dí)Western blot 分析。A. 生物反應器(qì)運(yùn)行(háng)WVD 的工(gōng)作體積(jī)為10 升。
B. 生(shēng)物(wù)反(fǎn)應(yīng)器運(yùn)行(háng)WVC 的工作體積(jī)為(wéi)500 升。MWM=分(fēn)子量(liáng)標準。
結(jié)論
成(chéng)功的灌(guàn)流工(gōng)藝是在(zài)培養物健康與*產(chǎn)量(liáng)之間(jiān)達(dá)到(dào)平(píng)衡。適(shì)合*的細(xì)胞生長和對(duì)生長有(yǒu)利的(dí)因素可能(néng)對(duì)生(shēng)產不利。例如，增加灌流(liú)速率以(yǐ)去除(chú)毒(dú)性物質(zhì)會將產物稀釋到很低的濃度，為下遊處(chǔ)理帶(dài)來不便(biàn)，更不用說與(yǔ)灌流(liú)增(zēng)加(jiā)相關的商品費(fèi)用(yòng)增加。對(duì)培養基成(chéng)分，添加劑以(yǐ)及投料策略的調(tiáo)整可能會增(zēng)加(jiā)灌流(liú)的(dí)天數(shù)，而不(bù)稀釋(shì)蛋白的濃度水平。有報(bào)道(dào)在生物反(fǎn)應器(qì)運行中采用(yòng)兩種不(bù)同的培養(yǎng)基配方(fāng)來(lái)控製細胞代謝可降(jiàng)低(dī)細(xì)胞(bāo)生(shēng)長，同
時維持(chí)其(qí)活(huó)力，從(cóng)而延(yán)長(cháng)收獲產(chǎn)物的(dí)天數1。從生物反應器中去除(chú)細胞也是一(yī)個選擇，我們(mén)將它加入工(gōng)藝(yì)中(zhōng)來控(kòng)製細胞(bāo)密度(dù)。這很難頻繁(fán)處理(lǐ)，並(bìng)增(zēng)加(jiā)了生(shēng)物(wù)危害(hài)的廢(fèi)料。如果一(yī)
種培養基配方能(néng)支(zhī)持早期的快速(sù)細胞(bāo)生(shēng)長(cháng)，然後在生(shēng)產中控製細胞生長(cháng)，那是(shì)的。
一次性的生(shēng)物反(fǎn)應(yīng)器比(bǐ)反復使用(yòng)的生(shēng)物反應器在清洗(xǐ)，滅(miè)菌，驗(yàn)證，安裝(zhuāng)和(hé)運行(háng)之(zhī)間(jiān)的轉換(huàn)時間上更具(jù)優(yōu)勢(shì)。我(wǒ)們(mén)證(zhèng)明了25升，100升和(hé)500升(shēng) 工作體(tǐ)積(jī)的(dí)係(xì)統運(yùn)行在(zài)細胞生長，蛋白(bái)產量(liáng)，葡(pú)萄(táo)糖(táng)消(xiāo)耗(hào)以及乳酸生產上是(shì)相(xiāng)當的。
文章(zhāng)來源(yuán)：BioProcessing™ 雜誌(zhì)
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